PCR基因扩增实验室设计建设

一、PCR的认识
临床基因扩增实验又称  PCR实验,PCR 是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,是一种分子生物学技术,用于放大特定的 DNA 片段,可看作生物体外的特殊 DNA 复制。PCR实验室是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法,测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点,因此被临床医生广为认可,已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。

                                                                           PCR基因扩增实验室设计
二、依据标准规范
设计PCR实验室应满足《实验室生物安全通用要求》国家标准GB19489-2008[4]、《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8 号文[5]、《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10 号文[6]、《临床基因扩增检验实验室设计标准》卫医发[2002]10 号文附件。
三、PCR实验室布局
PCR实验室根据其工艺流程主要分为试剂准备区、核酸提取区、扩增区和产物分析区 4 个单独的工作区域,其中试剂准备区、核酸提取区为扩增前区,扩增区、产物分析区为扩增后区。

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四、实验室气压控制
PCR 实验室并没有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。
(1)试剂贮存和准备区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。
(2)标本制备区主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定 RNA 时 cDNA 的合成。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。
(3)扩增反应混合物配制和扩增区主要进行的操作为 DNA 或  cDNA 扩增。此外,已制备的 DNA 模板和合成的 cDNA(来自样本制备区)  的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)  制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式  PCR 测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。
(4)扩增产物分析区主要进行的操作为扩增片段的测定。本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

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五、PCR实验室仪器设备
(1)试剂准备室
试剂准备室主要承担 PCR 实验过程中试剂的配制、分装和保存。主要设备包括实验台、试剂柜、冰箱、天平、离心机、加样器、振荡器、紫外灯等。
(2)核酸提取室
核酸提取室主要承担样品核酸的提取,样品的混样和测试样品的制备。主要设备包括实验台、冰箱、生物安全柜(或通风柜、洁净工作台)、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴锅、紫外灯等。其中生物安全柜、通风柜和洁净工作台的选择与测试样品的特性有关,生物安全柜主要用于疾控中心、医学实验室等;通风柜主要用于植物 DNA 检测和检疫等;洁净工作台主要用于对洁净条件要求较高的 PCR 实验。
(3)扩增室
扩增室主要承担核酸扩增反应的配制和模板加入。主要设备包括实验台、荧光定量 PCR 仪、荧光计、冰箱、生物安全柜(或通风柜、洁净工作台)、离心机、加样器、紫外灯等。
(4)产物分析室
产物分析室主要承担核酸产物的测定。主要设备包括实验台、测序仪、冰箱、离心机、加样器、紫外灯等。

 

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